DNA Mutasyonlarının Pcr Analizi İle Doğrudan Gösterilmesi

DNA Mutasyonlarının Pcr Analizi İle Doğrudan Gösterilmesi :

DNA'nın belirgin amplifikasyonun yapıldığı PCR analizi günümüzde moleküler tamda yaygın olarak kullanılmaktadır. Eğer başlangıç materyali olarak RNA kullanılıyorsa, öncelikle cDNA elde etmek için revers transkripsiyon yapılır, daha sonra PCR ile amplifiye edilir. Bu yönteme kısaca RT-PCR denilmektedir. Ancak burada normal genin sekansı mutlaka bilinmelidir. Mutant geni saptayabilmek için normal sekansın 3' ve S' uçlarına bağlanan iki primer oluşturulur. Uygun DNA polimerazları ve "termal cycling" kullanılarak hedef DNA amplifiye edilir ve iki primer arasındaki DNA sekansının milyonlarca kopyası elde edilir. Bundan sonra anormal dizinin saptanması birkaç şekilde olabilir.

• DNA içerdiği nükleotidlerin sırasına göre dizilendirilebilir ve bu nükleotid dizisi normal (wild-type) nükleotid dizisiyle karşılaştınlarak mutasyonlar saptanabilir. Daha önceleri bu işlem elle yapılmakta ve çok zaman almakta iken, günümüzde otomatik dizi aletleri ile genomik DNA' daki binlerce baz çifti birkaç saatte dizilendirilebilmektedir. Son zamanlarda genlerin veya genlerin bir kısmının dizilenmesi için kullanılan mikroarrayler de mevcuttur. Normal gen dizisine ve bilinen mutasyonlara karşı geliştirilen kısa DNA dizileri (oligonükleotidler) gen çipi üzerinde birbirine komşu olarak bağlanmakta ve test edilecek

DNA örneği bu array'e hibridlenmektedir. Hibridizasyondan önce örnek floresan ile boyanmaktadır. Eğer mutasyon yoksa hibridizasyon, dolayısıyla da ortaya çıkan floresan sinyal, normal sekansa karşılık gelen oligonükleotidde en belirgin olacaktır. Mutasyon varsa, mutant oligonükleotide hibridizasyon olacaktır. Daha sonra çip üzerindeki floresan hibridizasyon paterninden yüzbinlerce baz çiftinin DNA dizisi bilgisayar programları ile okunacak ve potansiyel mutasyonlar saptanacaktır.

• Diğer yöntemde ise DNA, dizilimleri spesifik bölgelerini tanıyan restriksiyon enzimleri ile sindirilip daha sonra kesilir. Eğer spesifik bir mutasyonun restriksiyon bölgesini etkilediği biliniyorsa, amplifiye edilen DNA sindirilebilir. Mutasyonun restriksiyon bölgesini etkilemesinden dolayı mutant ve normal allellerin ürünleri farklı boyutlarda olur ve bunlar agaroz jel elektroforezinde farklı bantlar olarak görülür. Bu yöntem otomatize veya array-temelli dizilerneden daha az çıktılı olmakla birlikte, mutasyonun her zaman aynı nükleotidde olduğu durumlarda yararlı bir moleküler tanı yöntemidir.

• Spesifik bir nükleotiddeki mutasyonları ortaya koymakta kullanılabilecek bir diğer yöntem PCR ürününe floresan işaretli nükleotidleri koymaktır. Örneğin KRAS onkogenindeki glisini [GGT] aspartik asite [GAT] dönüştüren bir kodon 12 mutasyonu için normal (G) veya mutant (A) diziye karşılık gelecek floresan işaretli C ve T nükleotidleri PCR ürününe eklenebilir. Bu nükleotidler farklı floroforlarla işaretlendiğinden, ortaya çıkan PCR ürününde primer ekstansiyon sırasında "C" veya "T", hangisinin yeraldığına göre onun renginde floresans saptanacaktır (Şekil 7-41). Bu "allel spesifik ekstansiyon" yönteminin avantajı normal ve anormal hücrelerden oluşan heterojen kanşımlarda (örneğin malignite olduğundan şüphelenilen vakalardan alınan klinik örneklerde) bile mutant DNA'yı seçebilmesidir. Bu temele dayanan birçok yöntem laboratuvar ve klinik düzeyde mutasyonlann saptanması için günümüzde kullanılmaktadır.

• PCR analizi aynı zamanda delesyon veya ekspansiyonla giden mutasyonlarda da çok yararlıdır. Daha önce de anlatıldığı gibi, frajil X sendromu gibi bazı hastalıklar trinükleotid tekrarlanyla seyreder. Trinükleotid tekrarlanndan etkilenen FMR -1 geninin 5' ucundaki sekansa bağlanan iki primer, aradaki sekanslan amplifiye etmek için kullanılır. Tekrar sayısında büyük farklılıklar olması nedeniyle, normal bireylerin ve premutasyonu olanların DNA'lanndan elde edilen PCR ürünlerinin büyüklüğü de oldukça farklıdır. Bu fark amplifiye DNA ürünlerinin jel üzerinde farklı migrasyonu ile gösterilebilir.

SENDE YORUM YAP!

Whatsapp